SAFE 与 SDE 法对金华火腿皮下脂肪气味活性物质研究

摘要:通过溶剂辅助风味蒸发系统( SAFE) 和同时蒸馏提取技术( SDE) 与气相色谱－嗅闻仪－质谱联机法( GC-O-MS) 结合，对已发酵 18 个月的金华火腿皮下脂肪气味化合物进行定性定量分析和感官评价。 SAFE 和 SDE 法分别检测并嗅闻到40 种和22 种气味活性化合物，对脂肪气味贡献度较大的 10 种关键性化合物分别是: 己醛、庚醛、二异丙基二硫醚、辛醛、反-2-辛烯醛、3-甲基丁酸、反，反-2，4-癸二烯醛、γ-癸内酯、γ-十一内酯和苯乙酸。
作为我国传统的腌腊制品，“金华火腿”以其的工艺，严格的选料和的制作方法造就出了自身皮薄骨细，腿心饱满，形似竹叶的优良特征，并且更以其的色、香、味享誉海内外。金华火腿中的香味是由肌肉组织和脂肪组织中挥发性气味成分协同影响的结果。在脂肪组织中，脂质主要以甘油酯、磷脂和游离脂肪酸的形式存在，随着火腿发酵程度的加深，这些物质通过脂肪酸降解、氧化以及美拉德反应等进一步生成挥发性物质。这些挥发性成分终形成了火腿皮下脂肪的特征风味。
目前，干腌火腿的气味检测中，样品的前处理方式种类很多，如固相微萃取技术( solid phase micro-extraction，SPME)，动态顶空制样技术( dynamicheadspace sampling，DHS)，同时蒸馏提取技术( simultaneous distillation extraction，SDE)和临界流体技术等前处理方法。而在金华火腿的风味研究中，应用为广泛的是固相微萃取技术，如章建浩等曾通过固相微萃取法对传统工艺下金华火腿的挥发性成分进行研究，赵改名等通过SPME-GC-MS ( solid phase microextraction-gaschramatograph-mass spectrography，SPME-GC-MS ) 法对金华火腿中挥发性气味物质的形成过程及变化规律进行了研究。在动态顶空技术中，宋焕禄曾通过 DHS-GC-O-MS ( dynamic headspace sampling-gaschromatograph-mass spectrography，DHS-GC-O-MS) 法并结合 DB-5 和 DB-WAX 两类色谱柱对金华火腿关键香味化合物以及化合物的形成途径进行探索。在同时蒸馏提取的方法中，尹晓婷等发现该方法在提取气味化合物的过程中，由于加热时间长并且受热强度大，金华火腿内部发生了 Maillard 反应，产生了一定量的醛类物质。在应用临界流体对金华火腿风味物质检测方面，田怀香等发现该技术对酸类物质提取率较高，对醛类、酮类提取率较低，并且对一些气味贡献度较大的物质，回收率不高。
作为顶空技术，SPME 和 DHS 技术对气味物质的提取多集中于分子量较小的挥发性物质; 在溶剂萃取技术中，SDE 技术解决了对较高分子量的挥发性成分提取的问题，但由于对样品处理中需要高温加热，导致对原始食品风味的破坏，且会产生原来样品中没有、加热产生的后生物( artifact) 。而作为一项新技术，溶剂辅助风味蒸发系统( solvent-assistedflavor evaporation，SAFE) 于 1999 年由 Engel W 等发明。 SAFE 是一种新型分离气味化合物的方法，它可以分为蒸馏系统和真空泵两个部分组成。通过SAFE 得到的风味提取物能够在感官上表现出与被提物的气味属性，并且对于复杂食品基质中的痕量挥发物有着良好的定量与定性效果。
本实验采用 SAFE 和 SDE 分离并提取金华火腿风味成分，通过气相色谱－嗅闻－质谱仪( gas chro-matography-olfactrometry-mass spectrometry， GC-O-MS) 对气味物质进行分析鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
金华火腿样品，金华金字火腿股份有限公司。金华火腿样品采用传统工艺制作，样品的发酵期已达 18 个月。取火腿外皮层下约 1 cm 处的脂肪部分50 g，并将其切成小块( 约 1 cm3) 并用滤纸包好，装入索氏抽提装置中。
1. 2 试剂与仪器
标准参考化合物，C7～ C30的正构烷烃和内标物2-甲基-3-庚酮，色谱纯，美国 Sigma 公司。
7890A-Sniffer 9000-7000B 型气相色谱－嗅闻－质谱联用仪，其中气相色谱仪，噢闻仪，质谱仪分别为美国 Agilent 公司、瑞士 Brechbuhler 公司、美国Agilent 公司生产; DB-Wax( 30 m × 0. 25 mm × 0. 25 μm)型色谱柱，美国 J＆W 公司; 溶剂辅助风味蒸发装置，德国 Glasblserei Bahr 公司; EXT75DX 型复合涡轮分子真空泵，XDD1 型机械泵，英国 Edwards 公司。
1. 3 气味物质前处理方法
1. 3. 1 SAFE 法处理样品
在索氏抽提装置中装入用滤纸包好的混合有内标物的 50 g 样品，内标物为 2-甲基-3-庚酮，使内标质量比达到 500 ng/g。在抽提装置下方连接的烧瓶中装入有机溶剂 120 mL( 乙醚 80 mL，正戊烷 40mL) ，有机溶剂水浴加热的温度为 45 ℃ 。将索氏抽提装置与恒温冷凝管相连接并设定冷凝水温度为15 ℃ 。索氏抽提 5 h，得到淡黄色透明液体。将淡黄色透明液体注入滴液漏斗( 1) 中，并盖好瓶塞密闭，待用。将1 000 mL的圆底烧瓶( 2) 置于水浴中加热( 3) ，水浴温度保持 45 ℃，收集黄色透明液体中的油相和水相。水浴入口( 4) 和水浴出口( 5) 处连接级恒温水浴器， SAFE 装置内部蒸馏头( 6) 和蒸馏腿( 7) 夹层水浴温度为 45 ℃。分子涡轮泵与高真空入口处( 8) 相连接，使 SAFE 装置中的真空环境达到5 × 10－ 3Pa。冷阱( 9) 和 250 mL 的圆底烧瓶( 10) 置于盛放液氮的保温瓶( 11) 中，收集黄色透明溶液中的富含气味物质的有机溶剂。将已分离出的有机溶剂经过低水硫酸钠干燥并通过 Vigreux 柱浓缩至 2 mL，用氮气吹扫至 0. 5 mL，得到透明低杂质的浓缩液并进行 GC-O-MS 分析，每次进样量为 1 μL。
1. 3. 2 SDE 法处理样品
在同时蒸馏提取装置的 1 000 mL 烧瓶中装入混有内标物的 50 g 样品、沸石和 500 mL 蒸馏水，内标物为2-甲基-3-庚酮，使内标质量比达到500 ng/g。
在 250 mL 的圆底烧瓶中加入 120 mL 有机溶剂( 乙醚 80 mL，正戊烷 40 mL) 。 1 000 mL 和 250 mL 烧瓶分别在 150 ℃的恒温油浴锅和 45 ℃恒温水浴锅中加热，样品加热至沸腾，同时蒸馏提取 5 h 后收集有机溶剂。将已分离出的有机溶剂经过低水硫酸钠干燥并通过 Vigreux 柱浓缩至 2 mL，用氮气吹扫至 0. 5mL，得到透明低杂质的浓缩液并进行 GC-O-MS 分析，每次进样量为 1 μL。
1. 4 GC-O-MS条件与 AEDA 分析
气相色谱柱温箱程序升温条件: 初始温度 40℃ ，保持时间 3 min，然后以 5 ℃ / min 升至 200 ℃ ，以10 ℃ / min 至温度 230 ℃ ，保持 3 min。进样口温度为250 ℃ ，载气为 He，流速为 1. 2 mL / min，分流比 1∶ 1。质谱条件，离子源温度 230 ℃，电压70 eV，离子化方式为 EI。灯丝发射电流 35 μA，扫描质量范围为45 ～ 650 m / z，扫描时间为 200 ms，检测电压为 350V。嗅闻仪接口处的温度为 200℃ ，载气为高纯氮气和水蒸气的混合气体。气味活性物质 GC-O 分析包括记录气味物质保留时间、强度和气味特征，由 3 名专业感官评价人员共同确定并完成。
芳香萃取物稀释分析( aroma extract dilution a-nalysis，AEDA 分析) 时，浓缩液通过乙醚和正戊烷的混合液( 比例为 2∶ 1) 按照 1∶ 3的比例进行稀释，并将稀释后的浓缩液进行 GC-O-MS 分析，直到嗅闻口低法嗅闻到化合物气味为止，每个化合物的稀释倍数规定为其 FD 因子。
1. 5 数据处理方法
未知化合物定性分析: 化合物在 GC-MS 上的采集信息通过 Masshunter Workstation B. 03. 01 数据处理软件处理，在 NIST 谱库 2. 0 中检索，确定未知化合物的信息并与该物质的气味特性、标准化合物保留时间和文献所报道的气味物质线性保留指数相比较，共同确定气味物质种类。线性保留指数( LＲI值) ，以 C7～ C30正构烷烃作为标准并采用与待测样品相同的升温程序，计算出未知化合物的 LＲI 值，并与标准 LＲI 进行比对从而对物质进行定性。
气味化合物定量分析: 气味物质的定量方法采用内标法定量，内标物采用 2-甲基-3-庚酮。内标法计算公式: 目标物浓度 = 内标物浓度 × ( 目标物峰面积/内标物峰面积) 。实验数据处理由 SPSS Statistics17. 0 和 Microsoft Excel 2007 数据处理软件完成。
2 结果与讨论
2. 1 气味活性物质定性与定量分析结果
共检测并嗅闻到 48 种气味活性化合物，经分析鉴定出 45 种还有3 种未知物，其中 SAFE 和 SDE 法分别检测到 40 种和 22 种气味物质。烃类物质、硅氧化合物以及一部分苯系物由于并低特征气味未列在表中。在已鉴定出的 45 种气味物质中，醛类物质 12 种，醇类物质 2 种，酸类物质 10 种，酮类物质 4 种，酯与内酯类物质 6 种，硫醚类 3 种，含苯化合物 6 种，其他类物质 2 种。 SAFE 的气味物质种类明显高于 SDE，但 SDE 大分子醛、酸检测中则要优于 SAFE。定量结果中，SAFE 中乙酸乙酯、甲苯、己醛、二异丙基二硫醚、乙酸、3-甲基丁酸和辛酸含量较高( ≥1 ×10－ 6) 。而 SDE 中乙酸乙酯、己醛、二异丙基二硫醚、反-2-辛烯醛、二丙基三硫醚、2-十一碳烯醛、反，反-2，4-癸二烯醛、γ-癸内酯、十六烷醛、十八烷醛、癸酸和月桂酸含量较高 ( ≥1 ×10－ 6) ，但含量高并不能说明其风味贡献度较大，需结合气味活性化合物稀释因子和 OAV 值具体分析。
2. 2 GC-O 分析结果SAFE 中气味化合物的特征风味强度明显高于SDE。在小分子酸和内酯类物质方面尤为突出，如丁酸( LＲI，1596) 、3-甲基丁酸( LＲI，1638) 、戊酸( LＲI，1705) 、γ-己内酯 ( LＲI，1687) 、γ-壬内酯( LＲI，1890) 、γ-癸内酯( LＲI，2010) 、γ-十一内酯( LＲI，2127) ，这些物质在风味特征上具体表现在酸味、水果味和甜味方面。
火腿皮下脂肪关键性气味物质气味活性共有 10 种 Log3FD≥3 的关键气味化合物，化合物中贡献度较大的是二异丙基二硫醚和反，反-2，4-癸二烯醛，其次是反-2-辛烯醛、己醛、辛醛、庚醛等一些醛类，贡献度比较小的是一些酯类与酸类物质。
此外，还有 1-辛烯-3-酮，甲硫基丙醛，甲基( 2-甲基-3-呋喃基) 二硫醚等关键性气味化合物，这些化合物虽在色谱柱中未被检出，但嗅闻中强度较大，分别为火腿皮下脂肪贡献出了蘑菇味、土豆味、肉香，脂香等特征风味。通过对化合物定量并计算其 OAV 值可以发现，这 10 种气味物质的 OAV≥1，表明这些化合物对皮下脂肪的风味组成有直接影响。但表中气味物质的贡献度和嗅闻强度具有一定的出入，比如说，3-甲基丁酸、γ-癸内酯、γ-十一内酯、苯乙酸4 种气味化合物在 SAFE 的检测结果中，Log3FD 值为，但其 OAV 值却偏低，这可能是由于金华火腿皮下脂肪内部环境体系比较复杂，仅用文献报道中的单一环境下的阈值难以准确评价。因此，分析时应以香气强度直接表征气味化合物贡献度为主要分析方式，OAV 值仅作为一种参考。
气相色谱－嗅闻( GC-O)，共分为 9种气味类型，分别为酸味，甜味，清新味，油脂味，坚果味，葱蒜味，水果味，鲜花味和其他气味。除坚果味外，SAFE 的嗅闻强度结果远高于 SDE。
火腿皮下脂肪中的主体风味成分由油脂味、酸味和水果味构成。其中油脂味主要由一些直链醛和烯醛构成，如壬醛、癸醛、反，反-2，4-癸二烯醛和反-2-辛烯醛等; 酸味主要由小分子酸构成，如乙酸、2-甲基丙酸、丁酸和戊酸等; 水果味中贡献度比较大的是一些内酯类物质，主要体现在椰子和桃子味等方面，代表物质有 γ-壬内酯、γ-癸内酯和 γ-十一内酯等。鲜花味中，主要气味物质为苯乙醛、苯乙醇和苯乙酸，表现出玫瑰花香的特征; 一些含硫化合物，如二异丙基二硫醚和二丙基三硫醚在嗅闻过程中表现出浓郁的葱蒜味; 而坚果类特征风味主要体现在具有明显蒸煮土豆味的甲硫基丙醛上。清新味和甜味代表性化合物分别为小分子醛醇和酯，如代表清新口味的己醛、庚醛和己醇和代表甜味的 γ-己内酯。其他类型气味中，如代表蘑菇味的1-辛烯-3-酮，具有木香味和生面粉味的反-4，5-环氧基－反－癸醛和具有芹菜味 2-戊基癸酮等。
来源：惠合发酵罐厂家

发酵设备

SAFE 与 SDE 法对金华火腿皮下脂肪气味活性物质研究